O diagnóstico de botulismo baseia-se na identificação da toxina botulínica de Clostridium em laboratório e na observação dos sintomas clínicos, mesmo que por vezes sejam inespecíficos. De fato, a doença pode ser confundida com a síndrome de Guillain-Barré, poliomielite, acidente vascular cerebral, miastenia gravis e paralisia por carrapatos.
No botulismo alimentar, a imagem dos distúrbios neuromusculares e a ingestão de alimentos potencialmente contaminados são pistas importantes. A manifestação simultânea em pelo menos 2 pacientes que consumiram a mesma comida simplifica o diagnóstico. A confirmação é obtida pelo isolamento do microrganismo com cultura de amostras suspeitas de alimentos ou fezes do paciente e com a identificação de toxina botulínica em alimentos ou materiais biológicos (como sangue, suco gástrico e vômitos).
No botulismo da ferida, por outro lado, a pesquisa da toxina sérica ou o isolamento de Clostridium botulinum de uma amostra da lesão cutânea confirmam o diagnóstico.
